DNA korjausproteiinin MGMT estäminen syöpähoidossa

MGMT on DNA:n korjausproteiini ja kuuluu Direct Reversal –korjausjärjestelmään.

(Engl. O6- alkylguanine DNA alkyl transferase (AGT) repair

AGT repair is a DNA repair protein encoded by MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase) removes DNA adducts from O6 methylguanine. The failure in the repair system results in G to A transition and DNA strand break observed in hematopoietic tumors, breast, ovarian and retinoblastomas ). www.molecular-cancer.com/content/6/1/26

Jos MGMT ei toimi ei pystytä DNA:n sisällä korjaamaan alkyloitunutta G -emästä ja voi tapahtuu luennassa G-A transition(eikä normaali G -C linjan luenta) ja DNA:n säikeen katko.

Mutta syöpäkasvaimen suhteen taas koetetaan saada aikaan tällaista DNA-vauriota syövässä, jotta se saataisiin pysähtymään solu solulta niiden alkaessa jarruttaa solusykliä.

Suomennosta abstraktista.

Eräs vaikea syöpälaji haimasyöpä on hyvin kestokykyinen sellaisia syöpälääkkeitä vastaan, jotka alkyloivat DNA:ta. Yksi syy on, että haimasyövässä on korkeat pitoisuudet tätä MGMT -entsyymiä, DNA:n korjausproteiinia.

(MGMT= DNA repair protein, O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase).

Miten voidaan saada syöpäkudos herkemmäksi (alkyloivalle) sytostaattiselle lääkeaineelle?

Voidaan koettaa inaktivoida tämä MGMT-entsyymi jollain inhibiittorilla, kuten tutkijat abstraktissaan kertovat.

He käyttivät erästä MGMT inhibiittoria BG (O6-benzyyli-guaniinia).

Alkyloivat aineet , jolla syöpäsoluja tutkittiin, olivat tässä carmustine (BCNU) ja temozolomide (TMZ).

Mikä oli p53 osuus?

Tutkijat huomasivat, että jos p53 tekijä( genomin suojelija) oli mutatoitunut, kombinaatioterapia TMZ +BG tehosi huonommin kuin silloin, jos p53 oli kunnossa.

TMZ + BG aiheutti solusyklin pysähtymän tekemällä DNA-vaurion ja solut joutuivat apoptoosiin, varsinkin haimasyöpäkudoksessa. Apoptoosi välittyi p53 tietä, sillä oletetaan , että p53 kontrolloi solusyklin jarruttumista (arrest) joko G1/S tai G2/M kontrollipisteissä antamalla pro-apoptoottisen vasteen.

KTS kuva: P53 kohdeproteiinit, joiden kautta p53 vaikuttaa apoptoosin:

http://www.nature.com/nrc/journal/v1/n1/images/nrc1001-068a-f1.gif)’

Tutkijat selvittivät edelleen mekanismia, jolla funktionaalinen p53 tekijä vaikutti omalta osaltaan korjaamattomien O6-metyyliguaniinien toksisuuteen.

Mutatoitunutta p53 tekijää Mut-P3 sisältänyt solulinja (Capan-1) sisältää korkeat basaalipitoisuudet p53, p21, Bax ja Bcl-2 ja näitten proteiinien pitoisuudet pysyvät muuttumattomina, kun käsitellään kombihoidolla BG + TMZ.

Mutta jos käsiteltiin sitä linjaa jossa on normaali p53 (Capan-2 linjaa) osoittautuu tapahtuvan merkitsevä indusoituminen genominsuojelijatekijässä p53 ( joka on tuumorisuppressori) sekä p21 tekijässä samaisella kombikäsitelyllä.

Eräällä TUNLl-menetelmällä voitiin osoittaa kombikäsittelyn (TMZ+BG) jälkeen, että normaalilla p53 tekijällä saatiin aikaan huomattavasti suurempi, kaksinkertainen apoptoottinen indeksi, verrattuna mutantti-p53-linjaan. Tämä vaste korreloi BAX-expression indusoitumiseen.

Merkitsevän tärkeää tässä on p53 proteiinin vaikutus mismatch-korjaus (MMR) proteiinin hPMS2 esiin indusoituminen, joka taas osallistuu jälkipäätöksiin tunnistettuaan O6-metyyliguaniini mismatch-emäsparin esiintymisen ja voi johtaa solun kuolemaan.

(KTS MMR http://www.nature.com/cr/journal/v18/n1/full/cr2007115a.html )

(MMR komponentit: :

http://www.nature.com/cr/journal/v18/n1/fig_tab/cr2007115t1.html#figure-title

Basaaliset pitoisuudet hPMS2, p21 ja BAX-proteiineja oli merkitsevästi matalammat kun p53 oli normaali verrattuna mutantti Mut-p53-soluihin

Kombiterapian jälkeen(BG+TMZ) säätyi ylös hPMS2 normaalin p53 omaavissa soluissa, kun taas mutantti-53 soluissa sen pitoisuudet laskivat (=MMRjärjestelmä osallistuu jatkossa)

Ylläolevan kanssa yhdenmukaisesti: solusyklin pysähtymän indusoiminen PI3K/CDK inhibiittorilla (7-OH-staurosporin) mutantti-p53:n omaavat haimasyöpäsolusiirrännäiset johtivat koe-eläimessä selvästi tuumorikasvun viiveeseen vasteena kerta käsittelylle TMZ+BG.

(Solusyklin pysähtymä sinänsä voi olla p53:sta riippumatonkin:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=eurekah&part=A20842)

LÄHDE: Sabapathi Sathishkumar, Seema Gupta, Mansoor M. Ahmed and Demetrius M. Kokkinakis Role of p53 and cell cycle arrest in the sensitization of pancreatic tumors to temozolomide University of Kentucky, Lexington, KY and University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA

Ref: Kokkinakis DM, Ahmed MM, et al. Sensitization of pancreatic tumor xenografts to carmustine and temozolomide by inactivation of their O6-Methylguanine-DNA methyltransferase with O6 benzylguanine or O6-benzyl-2’-deoxyguanosine. Clin Cancer Res. 2003 Sep 1;9(10 Pt1):3801-7.

http://aacrmeetingabstracts.org/cgi/content/abstract/2004/1/1299

DNA:n korjaantuminen suoraa entsyymillä, uutisia

Uutiset näistä entsymaattisesta DNA korjauksesta , Direct reversal

Suora entsymaattinen DNA:n korjaus

DNA voi korjaantua siis aivan suoraan entsymaattisesti ilman monimutkaisemman replikaatiofunktion osuutta.

Näitä on 4 erilaista mekanismia ( Kts. edellinen artikkeli) . PubMed antaa 3 artikkelia, jossa kuvataan näistä uusia asioita Hakusana DNA Repair Direct Reversal

LÄHDE 1. Bakteeri-itiöiden sitkeyden taustaa

FOTOLYAASI

Chandra T, Silver SC et al. Spore photoproduct lyase catalyzes specific repair of the 5R but not the 5S spore photoproduct. J Am Chem Soc. 2009 Feb 25;131(7):2420-1.Related Articles

Bakteerien itiöt ovat aivan ihmetyttävän kestäviä kaikenlaista kemiallista ja fysikaalista stressiä kohtaan, myös UV-sädetystä vastaan. Epätavallinen UV-säteilyn kestävyys bakteerien itiöissä johtuu niiden ainutlaatuisesta itiö-DNA:n fotokemiasta, joka aiheuttaa, että kertyy 5-thyminyyli-5,6-dihydrothymiiniä (SP-materiaa, itiöitten valotuotetta, spore photoproduct) ja sitä liittyneenä akkumuloituneen vaurion tehokkaasti korjaavaan SPL-entsyymiin, fototuotteen lyaasiin, fotolyaasiin.

SPL on jäsen radikaaleissa AdoMet superperheen entsyymeissä ja se hyödyntää rauta-rikki-kertymiä ja S-adenosyylimetioniinia (SAM) korjatakseen SP tuotteen mainitulla ”suoralla reversiolla” ( direct reversal mechanism) kiskomalla H-atomin thymiinidimeerin C6 hiilestä.

Bakteerien itiöitä UV-säteilytettäessä voi muodostaa periaatteeessa kaksi SP-diastereomeeriä (5R ja 5S) , mutta vain 5R-konfiguraatiota on mahdollista muokata lähellä olevista thymiineistä DNA:n kaksoishelixistä riippuen DNA rakenteen asettamista rajoituksista . Mutta 5S konfiguraation muodostuminen on mahdollinen vähemmin täsmällisissä DNA-rakenteissa tai säikeitten välisissä poikkisidoksissa.

Tutkijat analysoivat SP stereokemialliset erot ja osoittivat, että fotolyaasientsyymi SPL korjaa SP-tuotteessa olevat 5R isomeerit ainoastaan. SPL –entsyymin substraattina on siis 5R-SP eikä 5S-SP ja tämä tieto pitää yhtä sen havainnon kanssa, että kun UV-säteilytetään bakteerien itiöiden DNA:ta in vivo, tuottuu vain 5R-SP isomeeriä.

LÄHDE: 2. Tavallisimmat alkylaatiot mA ja mC

Leiros I, Nabong MP et al. Structural basis for enzymatic excision of N1-methyladenine and N3-methylcytosine from DNA. EMBO J. 2007 Apr 18;26(8):2206-17. Epub 2007 Mar 29.

Yksinkertaisiin DNA-säikeisiin toksiinien ja mutageenien aiheuttamsta alkylaatioista on tavallisimmat tyypit

N(1)-metyladeniini(m(1)A)

N(3)-metyylicytosiini (m(3)C)

Sekä bakteereilla että ihmisillä on osoitettu m(1)A ja m(3)C alkylaatioitten korjautuvan AlkB-välitteisellä oksidatiivisella demetylaatiolla, mikä on suora DNA-vaurion palauttava mekanismi (direct reversal).

Mutta Archea-lajeissa ei ole todettu AlkB-geeni-homologeja. Miten niillä DNA pystyy korjautumaan?

Tutkijat osoittivat, että lajilla Archaeoglobus fulgidus, nuo mainitut alkylaatiot m(1)A ja m(3)C korjaantuivat AfAlkA base excision repair glycosylase-menetelmällä. Siis tuossa kolmannessa elämän domaanissa toimisi toinen mekanismi. Lisäksi havaittiin, että AfAlkA aiheutti runsaan 1,N(6)-ethenoadenine excision .

Tutkijat esittivät AfAlkA kiderakenteen luonnehtien sitä myös pistemutaatioilla ja esittivät täten uuden löydön base excision- aktiivisuudesta

LÄHDE 3. DNA:n korjautumisessakin on kunto tärkeä

Kreklau EL, Limp-Foster M, Liu N, Xu Y, Kelley MR, Erickson LC.A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 2001 Jun 15;29(12):2558-66.

DNA:n korjaamiskyky (DNA repair status) on tärkeä seikka mutageneesissa, carsinogeneesissa ja genotoksisten aineitten kestokyvyssä. Koska DNA:n korjaamisprosessit käsittävät monia entsymaattisia askeleita, on solun DNA:n reparatiivisen kyvyn ymmärtämiseksi tarvinnut kehittää useita tutkimusmenetelmiä.

Tässä tutkijat esittävät uuden kehittelemänsä koeputkimenetelmän, jolla voidaan määrittää yksinkertaisista solu-uutteista kvantitatiivisesti alkylaatioitten korjaantuminen MGMT tietä ja BER-tietä , jossa on mukana MPG glykosylaasientsyymi, hOGG1 glykosylaasientsyymi ja hiivan ja ihmisen abaasinen endonukleaasi ( APN1 ja vastaavasti APE/ref/1

MGMT= O(6)-methylguanine DNA methyltransferase , korjaa poistamalla metyyliä

BER= base excision repair, korjaa poistamalla virheellisen emäksen

MPG= methylpurine DNA glycosylase

hOGG1= human 8-oxoguanine DNA glycosylase (hOGG1)

APN1= yeast abasic endonuclease

APE/ref-1 = human abasic endonuclease

Tämä lähestymistapa käsittää sellaisen solu-uutteen valmistuksen, jossa on yleispuskurissa kaikkia DNA-korjausprosessiin osallistuvia proteiineja aktiivina ja käytetään fluorometrisesti merkattuja stabiileja oligonukleotidisubstraatteja, joissa on jokaiselle DNA-korjausproteiinille spesifisiä DNA-leesioita.

Tämä metodi tekee mahdolliseksi määrittää metylaatio ja BER-kapasiteetit nopeasti pienestä määrästä alkunäytettä. Lisäksi fluorometristen oligonukleotidien stabiliteetilla vältetään substraatin muuntuvuus, mitä jatkuva radioaktiivinen merkkaus aiheuttaa

(Kts. mahdolliset metylaatiokohdat

http://www.mgmt-agt.net/Methylation%20sites2.jpg)

Tässä raportissa tekniikkaa sovellettiin ihmisen rintasyöpäsoluihin (MDA-MB231), jotka ilmentävät ylimäärin ihmisen MPG entsyymiä, jotta voitiin mitata, muuttaako BER- järjestelmän alkuvaiheen ylössäätyminen aktiivisuutta muissa valituissa BER (hOGG1) ja APE (ref-1 korjausjärjestelmissä tai suoraankorjaavaa (direct reversal) ( MGMT) aktiivisuutta.

Kommenttini:

Olen jo pitempään arvellut, että proteiinien ja antioksidanttien saantiin tulisi kiinnittää huomio DNA repair- statuksen ( tasapainon) kannalta, EIKÄ vain siltä kannalta, mitä keho erittää jännöstyppeä ja mikä on minimi tarve, että ei jouduta negatiiviseen typpitasapainoon jostain tuntemattomasta essentiellistä seikasta.

DNA:n korjaantuminen suoraa entsyymillä

Taustaa tekijöistä jotka vahingoittavat DNA:ta

Röntgensäteet, vapaat radikaalit, alkyloivat aineet ja spontaanireaktiot

aiheuttavat urasiilin muodostusta, abaasisen kohdan, 8-oxoguaniinia, ja yhden säikeen katkeamaa ( single strand break).

Näitä korjaa BER –järjestelmä , joka tarvitsee DNA-glykosylaaseja, APE1 endonukleaasia, DNApolymeraasi betaa ja XRCC1-DNA-ligaas1:tä. BER järjestelmässä on varsinaista DNA:n synteesiä jo mukana, mutta on olemassa myös suoran reversion järjestelmä, missä ei ole varsinaista DNA-synteesiä (replikaatiota) vielä mukana, vaan asia on entsymaattisella tasolla nikkaroimista.

”Direct Reversal” on tämän suoran korjauksen nimi

Tunnetaan neljä eri DNA-vaurion suorakorjausjärjestelmää.

• Photolyase, fotolyaasientsyymi korjaa UV-säteilyn aiheuttaman vaurion pyrimidiinidimeerissä valosta riippuvassa reaktiossa. Tämä korjaus tapahtuu bakteerilla, mutta ei ihmisellä.

• DNA ligaasi korjaa yksinkertaisen DNA mutkan.

Ihmissoluissa on useita DNA-ligaaseja, joilla on erilaisia tehtäviä niin DNA::n korjauksessa kuin monimutakisemmassa replikaatiossa. (Esim. Polymeraasi beeta on interaktiossa DNA-ligaasi I:n kanssa suoraan ja epäsuoralla tavalla taas XRCC1:n välityksellä . (1996). DNA-ligaasi III alfa muodostaa stabiilin kompleksin XRCC1:n kanssa ja on interaktiossa myös PARP1 ja PARP2:n kanssa.

Nämä molemmat proteiinit ovat interaktiossa keskenään ja polymeraasi beetan kanssa ja samalla tekevät linkin DNA ligaasi IIIalfan ja Base Excision Repair (BER)- ja single -strand break repair- mekanismeihin, koska XRCC1 ja PARP ovat jälkimmäisessä osallisia.

Suurin osa short patch repair- tapahtumista saadaan täydellisesti suoritetuksi DNA-ligaasi IIIalfa/XRCC1- kompleksilla.

DNA-ligaasi IIIalfa ei ole assosioitunut replikaatiofokuksiin eikä ole BER:ssä mukana , jos se tapahtuu lähellä replikaatiohaarukkaa) .

Poikkeavat metylaatiot DNA:ssa korjataan BER-systeemillä ja suoralla korjauksella joko metyylitransferaasilla tai oksidatiivisella demetylaasilla, joka on AlkB-tyyppiä.

• Metyylin poistajat, MGMT, O-metylguanine-DNA-methyltransferase

http://www.mgmt-agt.net/mgmt-function.JPG

Tämä entsyymi siirtää metyylin tai muun yksinkertaisen alkyyliryhmän O6-alkyyliguaniinista (O6-mG) tai O4-alkyylithymiinistä omaan cysteiiniinsä, jolloin entsyymi itse inaktivoituu vapauttaessaan nukleotidin. Tämä entsyymi luo soluissa resistenssiä Guaniinia O6-alkyloivien aineitten sytotoksisuutta vastaan. (Toisaalta solut voidaan tehdä herkiksi alkylaatiolle alentamalla tämän MGMT-entsyymin vaikutusta).

Jos O6-mG ei korjaannu, seuraa ”mismatch” thymiiniin päin (T) ja silloin joutuu mismatch repair ( MMR)- systeemi triggeröitymään ja apoptoosi voi seurata.

• Alkyylin irrottajat AlkB, hABH12, hABH3 ( human AlkB homologue)

Alkyloitunut DNA voi korjautua siten, että alkyyli voidaan saada irrotettua. Alfa-KG:sta ja raudasta riippuva oxygenaasi hydroxyloi DNA-emäksen alkyyliryhmän, jolloin alfa-KG muuttuu meripihkahapoksi ja alfa-KG:n C5 irtoaa hiilidioksidina Hydroksyloitu metyyli vapautuu spontaanisti formaldehydinä

Tällä korjauksella irtoaisi CH3- ryhmä 1-meA.sta tai 3-meC.stä korjaten adeniinin ja cytosiinin DNA.ssa ja RNA.ssa. Tekijää tai entsyymiä sanotaan AlkB (DNA and RNA), tai hABH12 (DNA) tai hABH3 (DNA and RNA).

Tästä on uutta tietoa vuodelta 2008:

Yang et al. [Nature 452 (2008)

AlkBrakenne DNA-kompleksissa on voitu määrittää, samoin humaani AlkB homologi 2 rakenne (hABH2) käyttämällä crosslinking-strategiaa, jolla on DNA-proteiinikompleksi stabiloitu. AlkB-proteiineilla on samanlainen katalyyttinen domaani, mutta DNA-tunnistusmotiivit ovat erilaisia. AlkB tekee kontaktin pääasiassa vaurioituneesen säikeeseen, mutta hABH2 tekee useita kontakteja molempien säikeitten kanssa . hABH2 luiskauttaa ulos vaurioituneen emäksen ja täyttää tyhjän paikan hydrofobisella aminohappotähteellä, samaan tapaan kuin DNA-glykosylaasit , essentiellisti niin, että DNA-kaksoishelixrakenne ei kierry. Sitävastoin AlkB puristaa niitä emäksiä yhteen, mitkä sijaitsevat irrotettavan emäksen kyljissä siten että irtiluiskahtava emäs joutuu pinon päälle. Tämä odottamaton irrotuskeino ja ero AlkB ja hABH2:n välillä DNA-säiekontaktissa selittää, miksi niillä on eri prioriteetit single strand break ja DSB DNA vaurioissa vastaavasti.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/picrender.fcgi?book=eurekah&part=A79604&blobname=ch4177f2.jpg

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/picrender.fcgi?book=eurekah&part=A79604&blobname=ch4177f4.jpg