Kerovuo J. Fytaasitutkimus Suomessa ( 2000)

Thesis:

KEROVUO Janne 2000FYTAASITUTKIMUS SUOMESSA

A novel phytace from bacillus

Matemaattis-luonnontieteellisessä tiedekunnassa esitettiin 23.5.2000 tarkastettavaksi FM Janne Kerovuon väitöskirja "A novel phytase from bacillus. Characterization and production of the enzyme".Tutkimus kuuluu biokemian alaan. Vastaväittäjänä oli professori Harry J. Gilbert (University of Newcastle Upon Tyne) ja kustoksena professori Carl G. Gahmberg.

Tausta:

Maailman viljellystä alasta yli 90 % käytetään palko-, vilja- sekä öljysiemenkasvien viljelyyn. Eräs tärkeä ainesosa näissä kasveissa on fytiinihappo (myo-inositoli-heksakisfosfaatti). Vilja- ja palkokasveissa fytiinihappo toimii fosfaattivarastona ja voi sisältää yli 80 % kokonaisfosfaatista. Fytiinihappo toimii myös myo-inositolin, tärkeän kasvutekijän, varastona. Lisäksi fytiinihapon hydrolyysituotteilla on monia fysiologisia vaikutuksia kasvisoluissa.

Kemiallisen rakenteensa takia fytiinihappo on erittäin stabiili molekyyli. Se poikkeaa muista organo-fosfaattimolekyyleistä suuren fosfaattipitoisuutensa takia. Tästä johtuen fytiinihapolla on voimakas negatiivinen varaus laajalla pH-alueella. Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa fytiinihappo sitoo itseensä tärkeitä mineraaleja kuten kalsiumia, magnesiumia, rautaa ja sinkkiä. Lisäksi fytiinihappo sitoutuu aminohappoihin ja proteiineihin ja inhiboi ruuansulatusentsyymejä. Tämän vuoksi fytiinihappo on haitallinen yhdiste kasviperäisissä eläinten rehuissa ja siksi sen hydrolysointi on suotavaa.

Fosfataasit ovat entsyymejä, jotka hydrolysoivat erinäisten organo-fosfaattimolekyylien monofosfoesterisidoksia. Nämä entsyymit eivät kuitenkaan pysty hydrolysoimaan fytiinihapon monofosfoesterisidoksia vaan tähän tehtävään on kehittynyt erityinen entsyymiluokka – fytaasit. Fytaasit hydrolysoivat fytiinihapon monofosfoesterisidoksia muodostaen vähemmän fosforyloituja myo-inositolifosfaatteja vapauttaen samalla epäorgaanista fosfaattia. Fytaaseja on tavattu mikrobeista, kasveista sekä tietyistä eläinkudoksista. Useita fytaaseja on kloonattu sekä karakterisoitu. Useat näistä entsyymeistä ovat samankaltaisia ja näiden reaktiomekanismi on sama kuin histidiini-hapan-fosfataaseilla. Tämän vuoksi näiden entsyymien sanotaan muodostavan histidiini-hapan-fosfataasien fytaasi -alaluokan.

Märehtijät hydrolysoivat fytiinihappoa ruuansulatuskanavan mikrobiflooran erittämien fytaasien avulla. Yksimahaiset eläimet kuten siat, siipikarja ja kalat eivät sen sijaan pysty hydrolysoimaan fytiinihappoa, sillä niiden ruuansulatuskanavassa ei juurikaan ole fytaaseja tuottavia mikrobeja. Tämän vuoksi näiden eläinten rehuun usein lisätään epäorgaanista fosfaattia turvaamaan riittävä fosfaatin saanto ja nopea kasvukyky. Lisätty epäorgaaninen fosfaatti ei kuitenkaan poista yllä mainittuja fytiinihapon haittavaikutuksia vaan ne voitaisiin poistaa lisäämällä rehuun fytaasientsyymiä epäorgaanisen fosfaatin sijaan. Tällöin fytiinihapon entsymaattinen hydrolyysi eläimen ruuansulatuskanavassa vähentää fytiinihapon haitallisia vaikutuksia sekä poistaa tai ainakin vähentää lisättävän epäorgaanisen fosfaatin määrää rehussa. Näin fytaasi on myös ympäristöystävällinen tuote, joka vähentää ympäristöön aiheutuvaa fosfaattikuormaa. Tämän vuoksi fytaasista on tullut tärkeä teollisuusentsyymi ja kiivaan tutkimuksen kohde.

Myo-inositolifosfaatteja tavataan myös eläinsoluissa, joissa ne toimivat muun muassa signaalin välittäjinä. Näin ollen näitä yhdisteitä voidaan käyttää metabolisissa tutkimuksissa, entsyymi-inhibiittoreina ja sen vuoksi myös potentiaalisina lääkeaineina. Myo-inositoli-fosfaattien kemiallinen synteesi on kuitenkin erittäin vaikeaa. Siksi fytaasi, joka spesifisesti hydrolysoi fytiinihappoa tietyiksi myo-inositolifosfaatteiksi, voisi olla hyödyllinen näiden yhdisteiden teollisessa tuotannossa.

Tutkimuksessa löydettiin uusi fytaasi. Tämä Bacillus -fytaasi poikkeaa huomattavasti muista fytaaseista. Se ei kuulu histidiini-hapan-fosfataasien fytaasi -alaluokkaan. Entsyymi saattaa olla potentiaalinen sekä eläinrehusovelluksissa että erityisten myo-inositolifosfaattien entsymaattisessa valmistuksessa. Tutkimuksessa esitetyt tulokset, yhdessä hiljattain julkaistun Bacillus -fytaasin rakenteen kanssa, viittaavat uudenlaiseen fytiinihapon hydrolyysitapaan. Lisäksi tutkimuksessa kehitettiin tehokas menetelmä fytaasin tuottamiseksi.