Pystyykö IP6 liittymään proteiiniin vai ei?

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26397942
Artikkeli 23. syyskuuta 2015+ Jio C et al. On syntetisoitu biotinyloitu  IP6 , jolal voi tutkia DNA DSB korjaantumista ja IP&-sitovien proteiinien affiniteetia.

Biochemistry. 2015 Sep 23. [Epub ahead of print]

Synthesis of biotinylated inositol hexakisphosphate to study DNA double-strand break repair and affinity capture of IP6-binding proteins.

Jiao C, Summerlin M, Bruzik KS, Hanakahi L.

TIIVISTELMÄ 

IP6 (fytiini)  on liukoinen  inositolipolyfosfaatti, jota on imettäväissoluissa runsaasti. Siitä huolimatta, että IP6 osallistuu  kriittisiin solufunktioihin, on voitu luonnehtia vain harva  IP6:een sitoutuva proteiini.

• Tässä työssään tiedemiehet raportoivat syntetisoineensa IP6- biotiinin, luonnehtineensa sen ja  soveltaneensa sitä käyttöön. IP6-biotiinissa biotiini on liitetty myo-inositolirenkaan 2- asemaan aminohexyylilinkillä.  Aivan kuten luonnon IP6 niin myös biotinyloitu IP6 stimuloi DNA-ligaatiota NHEJ- tapahtumassa in vitro ( Non-Homologous End-Joining) Ku on ainoa NHEJ-tekijä, jonka on osoitettu sitovan inositolihexafosfaattia IP6. 
•  https://www.ebi.ac.uk/interpro/potm/2004_7/Page2.htm

Abstract

Inositol hexakisphosphate (IP6) is a soluble inositol polyphosphate, which is abundant in mammalian cells. Despite participation of IP6 in critical cellular functions, few IP6-binding proteins have been characterized. We report on synthesis, characterization and application of biotin-labeled IP6 (IP6-biotin), which has biotin attached at the 2-position of myo-inositol ring via an aminohexyl linker. Like natural IP6, IP6-biotin stimulated DNA ligation by non-homologous end joining (NHEJ) in vitro. The Ku protein is a required NHEJ factor that has been shown to bind IP6.

•  Tiedemiehet totesivat, että IP6-biotiini pystyi affiniteetti-sieppaamaan Ku- proteiinia ja muita  vaadittavia NHEJ-faktoreita ihmissolu-uutteista ja niiden joukossa  oli  DNA.sta riippuvaisen proteiinikinaasin katalyyttinen alayksikkö (DNA-PKcs), XRCC4 ja XLF.

 We found that IP6-biotin could affinity-capture Ku and other required NHEJ factors from human cell extracts, including the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs), XRCC4 and XLF

•  Suoraan sitoutumiskokeissa rekombinantilla proteiinilla osoitautui että Ku oli ainoa NHEJ-faktori, jolla oli affiniteetti IP5-biotiiniin.  Soluextraktissa teki interaktion Ku:n kanssa DNA-PKcs, XLF ja XRCC4 ligaasiIV-kompleksi  joten interaktio  on todennäkösiesti epäsuora IP6-biotiiniin.

. Direct binding studies with recombinant proteins show that Ku is the only NHEJ factor with affinity for IP6-biotin. DNA-PKcs, XLF and the XRCC4:Ligase IV complex interact with Ku in cell extracts and likely interact indirectly with IP6-biotin.

• Sitten käytettiin IP6-biotiinia kytkemään  streptavidiini Ku-proteiiniin, mikä esti in vitro NHEJ taaphtuman. 

 IP6-biotin was used to tether streptavidin to Ku, which inhibited NHEJ in vitro. 

•  Näistä  oletusta  testaavista kokeista voi arvella,  että  IP6-biotiinin kaltaiset molekyylit voisivat toimia molekulaarisina kohteina biologisesti tärkeille  proteiineille, jotka sitovat IP6:ta ( joita siis halutaan tutkia ja tunnistaa- jos niitä on olemassakaan)

These proof-of-concept  experiments suggest that molecules like IP6-biotin might be used to molecularly target biologically important proteins that bind IP6.

•  IP6-biotiini affiniteetti-kaappauskokeet osoittavat, että lukuisat proteiinit sitovat spesifisesti IP6-biotiinia, kuten kaseiinikinaasi 2 (CK2), jonka tiedetään sitovan IP6 ja nukleoliinia. 

 IP6-biotin affinity capture experiments show that numerous proteins specifically bind IP6-biotin, including casein kinase 2 (CK2), which is known to bind IP6, and nucleolin.

•  Proteiinin sitoutuminen IP6-biotiiniin on selektiivistä, koska IP3, IP4 ja IP5 eivät kilpaile IP6-biotiiniin sitoutuvista proteiineista. Nämä tulokset ovat todiste siitä, että IP6-biotiini on hyödyllinen väline, jonka avull voi tutkia IP6:n osuutta biologisissa systeemeissä.

 Protein binding to IP6-biotin is selective, as IP3, IP4 and IP5 did not compete for binding of proteins to IP6-biotin. Our results document IP6-biotin as a useful tool to investigate the role of IP6 in biological systems.

PMID:

26397942

[PubMed - as supplied by publisher]

Kommentti vuodelta 2004 (P. Aas väitöskirjasta)  

NHEJ ja HR

DSB- vauriot voivat korjaantua joko

“non-homologous end joining” (NHEJ)- menetelmällä tai yleisesti ottaen tarkempaa homologisen rekombinaation (HR) tietä käyttäen.

Ihmisen soluissa DSB -vaurion korjaus tapahtuu pääasiallisesti NHEJ-tietä. Kuitenkin HR ja NHEJ voivat kilpailla DSB-vaurion korjaamisesta (2003), erikoisesti myöhäisen DNA-synteesi (S) faasin ja G2- faasin rajakohdassa, kun sisarkromatidit ovat lähellä toisiaan: Tässä kohtaa on HR päämekanismina DSB-korjauksessa.

NHEJ- menetelmä

Katkoskohdan päihin alkaa kertyä korjausproteiineja. NHEJ alkaa siten, että katkenneet DNA-päät kiinnittävät runsasta Ku70/Ku86 heterodimeeriä ja DNA-proteiinikinaasin (PK) katalyyttistä(c) alayksikköä(s) nimeltä DNA-PKcs. Tämä kinaasi aktivoituu, kun se kiinnittyy DNA-päihin ja fosforyloi proteiinin ARTEMIS.

DNA-PKcs ja ARTEMIS muodostavat kompleksin. Niin koeputkessa kuin kehossa tämä kompleksi toimii endonukleaasin tavoin ja trimmaa DNA-päät DSB-vauriokohdassa ( poistaa 5´ ja trimmaa pitkät 3´ pätkät) ja on kykenevä irrottamaan

( pilkkomaan) DNA-pinnimuodostumat, joita VDJ-rekombinaatiossa tulee. Arvellaan, että polymeraasi täyttää gap- aukkoa NHEJ:n aikana, mutta ei tiedetä, mikä niistä ( template -dependent fill in synthesis). Arvellaan, että Polymeraasi u ( myy) on asialla. (2002). Kohdan sinetöi sitten XRCC4-DNA ligaasi-IV-kompleksi.

Ketjut ovat korjautuneet ( error prone).

Jos tämä ARTEMIS joutuu inaktivoivan mutaation kohteeksi, seuraa kliinisesti vaikea kombinoitu immuunipuutostila (SCID) ihmisessä. Koe-eläimessä todetaan vastaavaa tilaa jos DNA-PKcs on toimimaton. Fenotyyppi johtuu funktionaalisen VDJ rekombinaatiokyvyn puutteesta.