Etiketter

Summa sidvisningar

Sidor

Leta i den här bloggen

måndag 5 oktober 2015

Pystyykö IP6 liittymään proteiiniin vai ei?

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26397942
Artikkeli 23. syyskuuta 2015+ Jio C et al. On syntetisoitu biotinyloitu  IP6 , jolal voi tutkia DNA DSB korjaantumista ja IP&-sitovien proteiinien affiniteetia.
Biochemistry. 2015 Sep 23. [Epub ahead of print]

Synthesis of biotinylated inositol hexakisphosphate to study DNA double-strand break repair and affinity capture of IP6-binding proteins.

TIIVISTELMÄ 

IP6 (fytiini)  on liukoinen  inositolipolyfosfaatti, jota on imettäväissoluissa runsaasti. Siitä huolimatta, että IP6 osallistuu  kriittisiin solufunktioihin, on voitu luonnehtia vain harva  IP6:een sitoutuva proteiini.

  • Tässä työssään tiedemiehet raportoivat syntetisoineensa IP6- biotiinin, luonnehtineensa sen ja  soveltaneensa sitä käyttöön. IP6-biotiinissa biotiini on liitetty myo-inositolirenkaan 2- asemaan aminohexyylilinkillä.  Aivan kuten luonnon IP6 niin myös biotinyloitu IP6 stimuloi DNA-ligaatiota NHEJ- tapahtumassa in vitro ( Non-Homologous End-Joining) Ku on ainoa NHEJ-tekijä, jonka on osoitettu sitovan inositolihexafosfaattia IP6. 
  •  https://www.ebi.ac.uk/interpro/potm/2004_7/Page2.htm

Abstract

Inositol hexakisphosphate (IP6) is a soluble inositol polyphosphate, which is abundant in mammalian cells. Despite participation of IP6 in critical cellular functions, few IP6-binding proteins have been characterized. We report on synthesis, characterization and application of biotin-labeled IP6 (IP6-biotin), which has biotin attached at the 2-position of myo-inositol ring via an aminohexyl linker. Like natural IP6, IP6-biotin stimulated DNA ligation by non-homologous end joining (NHEJ) in vitro. The Ku protein is a required NHEJ factor that has been shown to bind IP6.
  •  Tiedemiehet totesivat, että IP6-biotiini pystyi affiniteetti-sieppaamaan Ku- proteiinia ja muita  vaadittavia NHEJ-faktoreita ihmissolu-uutteista ja niiden joukossa  oli  DNA.sta riippuvaisen proteiinikinaasin katalyyttinen alayksikkö (DNA-PKcs), XRCC4 ja XLF.

 We found that IP6-biotin could affinity-capture Ku and other required NHEJ factors from human cell extracts, including the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs), XRCC4 and XLF

  •  Suoraan sitoutumiskokeissa rekombinantilla proteiinilla osoitautui että Ku oli ainoa NHEJ-faktori, jolla oli affiniteetti IP5-biotiiniin.  Soluextraktissa teki interaktion Ku:n kanssa DNA-PKcs, XLF ja XRCC4 ligaasiIV-kompleksi  joten interaktio  on todennäkösiesti epäsuora IP6-biotiiniin.

. Direct binding studies with recombinant proteins show that Ku is the only NHEJ factor with affinity for IP6-biotin. DNA-PKcs, XLF and the XRCC4:Ligase IV complex interact with Ku in cell extracts and likely interact indirectly with IP6-biotin.
  • Sitten käytettiin IP6-biotiinia kytkemään  streptavidiini Ku-proteiiniin, mikä esti in vitro NHEJ taaphtuman. 
 IP6-biotin was used to tether streptavidin to Ku, which inhibited NHEJ in vitro. 
  •  Näistä  oletusta  testaavista kokeista voi arvella,  että  IP6-biotiinin kaltaiset molekyylit voisivat toimia molekulaarisina kohteina biologisesti tärkeille  proteiineille, jotka sitovat IP6:ta ( joita siis halutaan tutkia ja tunnistaa- jos niitä on olemassakaan)
These proof-of-concept  experiments suggest that molecules like IP6-biotin might be used to molecularly target biologically important proteins that bind IP6.
  •  IP6-biotiini affiniteetti-kaappauskokeet osoittavat, että lukuisat proteiinit sitovat spesifisesti IP6-biotiinia, kuten kaseiinikinaasi 2 (CK2), jonka tiedetään sitovan IP6 ja nukleoliinia. 
 IP6-biotin affinity capture experiments show that numerous proteins specifically bind IP6-biotin, including casein kinase 2 (CK2), which is known to bind IP6, and nucleolin.
  •  Proteiinin sitoutuminen IP6-biotiiniin on selektiivistä, koska IP3, IP4 ja IP5 eivät kilpaile IP6-biotiiniin sitoutuvista proteiineista. Nämä tulokset ovat todiste siitä, että IP6-biotiini on hyödyllinen väline, jonka avull voi tutkia IP6:n osuutta biologisissa systeemeissä.
 Protein binding to IP6-biotin is selective, as IP3, IP4 and IP5 did not compete for binding of proteins to IP6-biotin. Our results document IP6-biotin as a useful tool to investigate the role of IP6 in biological systems.
PMID:
26397942
[PubMed - as supplied by publisher]

Kommentti vuodelta 2004 (P. Aas väitöskirjasta)  

NHEJ ja HR

DSB- vauriot voivat korjaantua joko
non-homologous end joining” (NHEJ)- menetelmällä tai yleisesti ottaen tarkempaa homologisen rekombinaation (HR) tietä käyttäen.
Ihmisen soluissa DSB -vaurion korjaus tapahtuu pääasiallisesti NHEJ-tietä. Kuitenkin HR ja NHEJ voivat kilpailla DSB-vaurion korjaamisesta (2003), erikoisesti myöhäisen DNA-synteesi (S) faasin ja G2- faasin rajakohdassa, kun sisarkromatidit ovat lähellä toisiaan: Tässä kohtaa on HR päämekanismina DSB-korjauksessa.

NHEJ- menetelmä

Katkoskohdan päihin alkaa kertyä korjausproteiineja. NHEJ alkaa siten, että katkenneet DNA-päät kiinnittävät runsasta Ku70/Ku86 heterodimeeriä ja DNA-proteiinikinaasin (PK) katalyyttistä(c) alayksikköä(s) nimeltä DNA-PKcs. Tämä kinaasi aktivoituu, kun se kiinnittyy DNA-päihin ja fosforyloi proteiinin ARTEMIS.
DNA-PKcs ja ARTEMIS muodostavat kompleksin. Niin koeputkessa kuin kehossa tämä kompleksi toimii endonukleaasin tavoin ja trimmaa DNA-päät DSB-vauriokohdassa ( poistaa 5´ ja trimmaa pitkät 3´ pätkät) ja on kykenevä irrottamaan
( pilkkomaan) DNA-pinnimuodostumat, joita VDJ-rekombinaatiossa tulee. Arvellaan, että polymeraasi täyttää gap- aukkoa NHEJ:n aikana, mutta ei tiedetä, mikä niistä ( template -dependent fill in synthesis). Arvellaan, että Polymeraasi u ( myy) on asialla. (2002). Kohdan sinetöi sitten XRCC4-DNA ligaasi-IV-kompleksi.
Ketjut ovat korjautuneet ( error prone).

Jos tämä ARTEMIS joutuu inaktivoivan mutaation kohteeksi, seuraa kliinisesti vaikea kombinoitu immuunipuutostila (SCID) ihmisessä. Koe-eläimessä todetaan vastaavaa tilaa jos DNA-PKcs on toimimaton. Fenotyyppi johtuu funktionaalisen VDJ rekombinaatiokyvyn puutteesta.

Inga kommentarer: