Solun apoptoosin säätely IP7 ja IP6K2 avulla

Solun elossapysymisen säätely HSP90 ja IP6K2:n avulla.

Apoptoosin säätelystä ja lääkevaikutuksesta 

" the pyrophosphate diphosphoinositol pentakisphosphate (5-PP-IP5, IP7), .... Novobiocin increases nuclear and decreases cytosolic IP6K2"
http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?IA=US2007025246&WO=2008073382&DISPLAY=DESC

Tätä yllä mainittua työtä kannatetaan US kansanterveyspalvelujen ja tieteelliseen tutkimukseen annetulla apurahalla . USA:n hallitus pidättää tietyt oikeudet inventioon. Invention teknisestä puolesta: Inventio käsittää proteiini-proteiini-interaktioita, erityisesti syöpälääkkeitten seulontaa. Suomennan alusta muutaman kappaleen.

Invention tausta:

INOSITOLIFOSFAATIT ovat tärkeitä solunsisäisiä signaalimolekyylejä ja näistä on kaikkein tunnetuin inositoli-1,4,5-trifosfaatti(IP3) , joka pystyy vapauttamaan solunsisäistä kalsiumia (Ca++). Insitolifosfaattien joukossa on viime aikoina alettu fokusoitua korkeampiin polyfosfaatteihin sekä inositolipyrofosfaattiin (IP7). Tämä IP7 on toiselta nimeltä 5-PP-IP5 (pyrophosphate diphosphoinositoli pentakisphosphate). Tämä muoto pystyy antamaan energeettisen fosfaatin eri proteiinikohteille.

IP7 muodostuu kehossa kolmella IP6K kinaasiperheen entsyymillä (IP6K1, IP6K2, IP6K3),
joista IP6K2, näyttää olevan assosioitunut apoptoosiin.
Apoptoottiset stimulukset huomattavasti lisäävät IP7-molekyylin (5-PP-IP5) muodostumista Entsyymin IP6K2 yliexpressio lisää solukuolemaa ja siRNA-indusoima depleetio taas edistää solun hengissäpysymistä.

Ns. lämpöshokkiproteiinit HSP, stressiproteiinit, omaavat klassisen roolin denaturoitujen proteiinien uudelleen laskostumisen edistäjinä. Tämän roolin lisäksi niillä on osoittautunut olevan osaa antiapoptoottisessa kaskadissa ja niistä on tullut anti-syöpälääkkeiden kehittelyssä kohteita.
http://en.wikipedia.org/wiki/Heat_shock_protein

On jatkuvasti tarvetta löytää uusia lääkeaineita syövän hoitoon.

YHTEENVETO INVENTIOSTA

(1) Yksi inventiomalli edellyttää metodia, jolla voidaan identifioida yhdisteitä, jotka vuorovaikuttavat IP6K2-proteiinin sitoutumisessa lämpöshokkiproteiiniin HSP90. Sellaiset yhdisteet ovat terapeuttisia kandidaattiaineita.
Ykkösproteiini, kakkosproteiini ja testiyhdiste asetetaan kontaktiin toistensa kanssa sillä edellytyksellä, että ykkös- ja kakkosyhdiste sitoutuvat toisiinsa, jos testiaine ei ole läsnä. ykkös ja kakkosproteiineina toimivat IP6K2 ja HSP90.
Määritetään ykkösproteiinista määrät, jotka sitoutuvat , tai irtoavat tai estyvät sitoutumasta kakkosproteiiniin. Terapeuttinen kandidaattiaine identifioidaan, jos yhdiste vähentää ykkösproteiinin sitoutumista kakkosproteiiniin tai vaikuttaa ykkösproteiinin irtoamisen kakkosproteiinsita tai estää ykkösproteiinin sitoutumasta kakkosproteiiniin.

ESIM.1— HSP90 ja IP6K2 saostuvat yhdessä
Tutkijat pohtivat, jos IP6K2 entsyymin nopea aktivaatio vasteena apoptoottiselle stimulukselle heijastaisi interaktiota toisiin proteiineihin. He kehittivät GDDA:n (Gestalt Domain Detection Algorithm) joka nopeutti havaitsemaan proteiini-proteiini tunnistusmotiiveja. Tällä GDDA-analyysillä havaittiin IP6K2:n aminohapposekvenssi 131-140, mikä muistutti hyvin konservoitua motiivia p23:ssa, joka on HSP90 chaperoniin korkealla affiniteetilla sitoutuva co-chaperoni.
Tämä sekvenssi on hyvin samanlainen IP6K2 ja IP6K3 entsyymeillä, mutta ei IP6K1 entsyymillä. Sekvenssianalyysin kanssa yhtenevänä tietona saatiin myös, että endogeeninen HSP90 saostuu yhdessä Myc-IP6K2 ja IP6K3 kanssa, mutta ei IP6K1:n kanssa.
Endogeeninen HSP90 HeLa-soluissa sitoutuu yliexpressoituvaan myc-IP6K2:teen .
Endogeeninen HSP90 ja endogeeninen IP6K2 saostuvat myös yhdessä hiiren aivosta.
Nisäkäsperäinen HSP90:n sitoutuminen immuunisaostettuun Myc-IP6K2:een vahvistaa, että interaktio on suora.

(2) Eräs inventiometodi on vastaava, mutta proteiinina on polypeptidejä ykkös- ja kakkos polypeptidit ovat kooltaan vähempiä kuin koko HSP90 tai koko IP6K2 proteiinit, mutta kuitenkin riittävän pitkiä sitoutuakseen.

ESIM.2. HSP90 estää IP6K2:n katalyyttisen aktiivisuuden
Jotta tutkijat saisivat varmuuden siitä, että HSP90 sitoutuminen IP6K2:teen säätelee IP6K2 aktiivisuutta myös in vivo ( kehossa), he merkkasivat HeLA ja HEK293 soluja tritium-inositolilla ja monitoroivat IP6 molekyylin muuttumisen IP7 molekyyliksi.( PP—IP5 muotoon) . Molemmissa solulinjoissa HSP90-yliexpressio vähensi noin puoleen IP6K2-entsyymin aktiivisuutta transfektoimattomissa soluissa ja myös soluissa, joihin oli transfektoitu IP6K2 .
Päinvastoin RNA-interferenssillä tehty HSP90-vaje lisäsi IP6K-aktiivisuutta.
Nämä löydöt viittaavat siihen, että HSP90:n sitoutuminen IP6K2 entsyymiin fysiologisesti estää tämän entsyymin katalyyttisen aktiivisuuden. Tutkijat ottivat selvää siitä mahdollisuudesta, jos IP6K2 aktiivisuus on hiivasolussa samalla tavalla säätynyt. Hiivasolu HSC82 muistuttaa ihmisen HSP90 sekä aminohappojärjestykseltään että läsnäololtaan basaaliolosuhteiden vallitessa. HSC82:n deleetio kohottaa IP7 molekyylin muodostumisen kaksinkertaiseksi, kun taas asiaan liittymättömän HSP:n (HSP1 04) deleetio ei lisää, vaan sensijaan hieman vähentää IP7:n muodostumsita.

(3) Eräs inventioaspekti käsitti metodin, jolla identifioitiin yhdisteitä, jotka vuorovaikuttavat humaanin IP6K2 entsyymiproteiinin ja humaani HSP90-proteiinin sitoutumiseen.
Testiyhdiste johdetaan solun kanssa kontaktiin. Solu käsittää kolme rekombinantti DNA-kosntruktia. Ensimmäinen konstrukti koodaa ykköspolypeptidiä, joka on fusoitu sekvenssispesifiseen DNA:ta sitovaan domaaniin . Toinen konstrukti koodaa kakkospolypeptidiä, joka on fusoitu transkription aktivoivaan domaaniin. Kolmas konstrukti käsittää reportterigeenin, joka sijaitsee alavirtaan DNA-elementistä, joka tunnistuu sekvenssispesifisellä DNA:ta sitovalla domaanilla. Ykköspolypeptidi on IP6K2 ja kakkospolypeptidi on HSP90 tai päinvastoin tai niistä riittävän pitkä polypeptidi. Määritetään reportterigeenin määrä yhdisteessä.

ESIM.3. Identifioidaan IP6K2:n sitova domaani
Tutkijat kartoitttivat IP6K2:n HSP90:tä sitovan domaanin ja vertasivat mutaatioentsyymiin. Jos oli tryptofaani-131 (W131) , IP6K2-HSP90 sitoutuminen oli kohtalaisesti vähentynyt.
Jos oli arginiini-133 (R133) , arginiini-136(R136) tai glutamaatti 138, 139(E138,139), sitoutumiskyky poistui.
Mutaatiossa IP6K2 W131A oli entsyymin IP6K2 katalyyttinen aktiivisuus vahvasti vähentynyt, mikä heijastuu sen vähentyneenä sitoutumisena substraattiinsa fytiiniin, IP6.
Mutaatiossa IP6K2 R133A ja IP6K2 E138-9 A on sama katalyyttinen aktiivisuus ja IP6:ta sitova kyky kuin IP6K2wt luonnollisessa entsyymissä.

(4) Eräs inventioaspekti on tämäkin: Määritetään ihmisen HSP90-proteiinin kvantitatiivinen määrä, jolla se sitoutuu ihmisen IP6K2-proteiiniin tai päinvastoin . Ykkösproteiini viedään kontaktiin kakkosproteiinin kanssa. Määritetään ykkösproteiinin se määrä, mikä sitoutuu kakkosproteiiniin.

ESIM 4— HSP90 sitoutuminen IP6K2-proteiiniin kumoaa solukuoleman(solun apoptoosin).

Ensin tutkijat ottivat selvää IP6K2 W131A mutanttientsyymin aktiivisuudesta koeputkitasossa. Yhtäpitävästi katalyyttisen aktiviteetin vähenemän kanssa in vitro, vastaavaa mutanttia transfektoitaessa saatiin paljon vähemmän entsyymiaktiivisuutta kuin luonnollisella entsyymillä IP6K2wt.
Ja päinvastoin, jos solut ilmensivät ylimäärin IP6K2-R133A tai IP6K2-E138-9A,jotka eivät pysty sitomaan HSP90, oli entsyymiaktiivisuus soluissa miltei kaksinkertainen verrattuna luonnolliseen IP6K2 entsyymiin.
Kun HSP:n yliesiintymä huomattavasti vähentää IP7 molekyylin muodostumista soluissa luonnolliseslla IP6K2-entsyymillä, niin mitään alenemaa IP7-muodostuksessa ei tapahtunut niissä soluissa, joissa esiintyi ylimäärin Rl33 A or E138-9A mutaatiomuotoja.
Täten havaitaan, että HSP90 (stressiproteiinin) sitoutuminen IP6K2:een fysiologisesti säätelee matalaksi IP7 molekyylin muodostumista.
Jotta voitiin määritellä, sääteleekö HSP90-IP6K2 sitoutuminen IP7-assosioitunutta solukuolemaa, transfektoitiin HeLA-soluja IP6K2 wt tai mutanttientsyymimuodoilla.
Jos luonnollista IP6K2wt entsyymiä yliexpressoitui, solukuolema kumoutui, ja tämän vaikutuksen muutti HSP90, jos sitä esiintyi saman aikaan.

Hämmästyttävästi se solukuolema, joka seuraa IP6K2 entsyymin mutanttimuotojen R133A and E138-9A yliexpressoitumisesta, oli viisi kertaa suurempi, mitä luonnollisen IP6K2wt entsyymin yliekspressiosta seurasi, ja niissä soluissa HSP90 ei onnistunut vähentämään solukuolemaa.

Niinpä voitiin todeta, että juuri endogeenisen stressiproteiinin HSP90 kyky sitoutua entsyymiin IP6K2, poistaa fysiologisesti solun apoptoottiset aktiot ( ja IP7 muodostus vähenee) .
Tätä johtopäätöstä tukee tieto siitä, että HSP90:n yli-expressoituminen ei onnistu vähentämään sellaista solukuolemaa, joka aiheutuu R 133 A and E138-9A mutanteista , jotka eivät voi sitoa HSP90:tä.

IP6K2 entsyymin katalyyttisen toiminnan tärkeys solukuolemassa, apoptoosissa, huomataan siitäkin, kun solukuoleman lisääntyminen jää tapahtumatta, jos katalyyttisesti vajeiset mutantit IP6K2 Wl 3 IA yliexpressoituvat.

(5) Eräs tutkimus tehtiin siten, että oli fuusioproteiini ykkös ja kakkospolypeptidistä. Kakkososana oli nisäkäsperäinen IP6K2, joka pystyy sitomaan HSP:tä ja ykköspolypeptidinä ei ollut osia IP6K2 proteiinista.

ESIM 5. Lääkkeen apoptoottinen potentiaali korreloi sen kykyyn estää IP6K2-HSP90 sitoutumista.
Koko joukko apoptooseja indusoivista anti-syöpälääkkeistä vaikuttavat ainakin osittain sitoutumalla HSP90- tekijään. Sellaisia lääkkeitä ovat geldanamycin johdannainen AAG (17-aminoallyl geldanamycin), novobiocin, ja cisplatin.
Tutkijat pohtivat, jos näitten ja muitten lääkkeiden apoptoottiset aktiot käsittävät puuttumisen HSP90-IP6K2 interaktioon.
HEK293 soluilla tehdyissä immuunisaostuskokeissa vähensivät cisplatin, novobiocin ja staurosporin IP6K2-HSP90- sitoutumista, kun taas AAG lisäsi tätä sitoutumista. Tutkijat selvittivät, että lääkkeet suoraan blokeerasivat IP6K2-HSP90 ja he mittasivat niiden suhteelliset tehokkuudet käyttämällä puhdistettuja proteiineja.
Novobiocin, cisplatin ja staurosporine vähensivät sitoutumista 50% (vastaavissa) pitoisuuksissaan (200 μM, 1- 5 μM ja 0.1 μM ).
Nämä tehokkuudet vastaavat hyvin näiden lääkkeiden soluviljelmissä osoittamiin tehoihin.

AAG ei estänyt sitoutumista intakteissa soluissa eikä koeputkessa.

Aiemmin ei ole raportoitu staurosporiinin sitoutuvan stressiproteiiniin HSP90. Tutkittiin sen vaikutus HSP90-sitoutumisees ATP-agaroosiin ja havaittiin 50% vähenemä sitoutumisessa staurosporiinin 0.2 μM pitoisuudessa , samaan tapaan kuten lääke oli osoittanut tehokkuuttaan myös irrottamalla IP6K2-HSP90- sitoutumistakin , mikä on johdonmukaista sen sitoutuessa suoraan HSP90-molekyyliin . Repeytyminen irti HSP90- sidoksesta vaikuttaa sykäyksen IP6K2-aktiviteettiin. Täten HeLa soluissa ( joissa on tai ei ole IP6K2 yliexpressio) cisplatiini, novobiosiini ja staurosporiini saavat aikaan lisääntyneen IP6K2 aktiivisuuden, kun taas AAG, joka lisää IP6K2-HSP90-sitoutumista, assosioituu vähentyneeseen IP7-muodostukseen
IP6K2-HSP90 sitoutumisen blokeeraaminen lääkkeillä oletettavasti johtaa lääkkeiden vaikuttamaan IP7 molekyylin generoitumisen lisääntymiseen. HEK-soluista on saatu samanlaisia tuloksia.